PolyShooter^TM

Transfection Reagent

Polymer Reagent For Transfecting Common Cell Lines

Catalog Number：P09110

01/產(chǎn)品概述

細胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子導入真核細胞內(nèi)以改變其基因型或表型的一種技術(shù)。隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制基因功能的常規(guī)手段，廣泛應(yīng)用于基因功能研究、調(diào)控基因表達、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等領(lǐng)域。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。其中化學介導方法因其兼具高效低毒、方便快捷等優(yōu)點，應(yīng)用廣泛?；瘜W介導方法包括經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法以及多種陽離子物質(zhì)介導的轉(zhuǎn)染方法。

理想的細胞轉(zhuǎn)染方法應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細胞毒性小等優(yōu)點。已有眾多文獻報道，脂質(zhì)體本身會參與細胞生理活動，影響基因表達，對研究數(shù)據(jù)產(chǎn)生一定程度的干擾。同時，脂質(zhì)體會對目的細胞造成細胞毒性，這種毒性是由其脂質(zhì)特性決定的。市面上多種商業(yè)化的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑要求細胞鋪板密度較高，以90%-95%為佳，這有助于減少陽離子脂質(zhì)體細胞毒性造成的影響。但是，如果研究的基因要求比較長的表達時間，例如細胞周期相關(guān)基因，或者細胞表面蛋白，又或者轉(zhuǎn)染后續(xù)需要進行繼續(xù)培養(yǎng)和功能研究，則不適合用脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑。目前眾多的研究者和生物公司將新一代轉(zhuǎn)染試劑的開發(fā)聚焦在非脂質(zhì)體的聚合物上，以尋找更高效低毒，同時對研究影響較小的轉(zhuǎn)染試劑。

LeapWal PolyShooter 轉(zhuǎn)染試劑，即PolyShooter Transfection Reagent是一種基于陽離子高分子聚合物的新型轉(zhuǎn)染試劑，適用于DNA、RNA的轉(zhuǎn)染。其原理為帶正電的高分子聚合物與核酸帶負電的磷酸基團形成帶正電的復合物后，與細胞表面帶負電的蛋白多糖相互作用，并通過內(nèi)吞作用進入細胞，隨后在胞質(zhì)中釋放，實現(xiàn)外源核酸的細胞轉(zhuǎn)染。

LeapWal PolyShooter 轉(zhuǎn)染試劑對多種常見細胞具有高水平轉(zhuǎn)染效率，具有高效低毒、操作簡單、重復性好等優(yōu)點。其*的配方使其可直接加入培養(yǎng)基中，血清的存在不會影響轉(zhuǎn)染效率，這樣可以減少去除血清對細胞的損傷。同時，轉(zhuǎn)染后不需要除去PolyShooter Transfection Reagent-核酸復合物或更換新鮮培養(yǎng)基，也可根據(jù)具體情況優(yōu)化轉(zhuǎn)染體系。

02/產(chǎn)品組分

03/保存條件

冰袋（wet ice）運輸。4℃保存，有效期6個月。-30℃至-10℃保存，有效期12個月，避免反復凍融。

04/產(chǎn)品特點

優(yōu)秀的轉(zhuǎn)染效率——針對廣泛類型的細胞，均表現(xiàn)出優(yōu)秀的轉(zhuǎn)染效率和高重組蛋白表達水平

細胞毒性低——作用溫和，能較好地實現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率與低細胞毒性之間的平衡

操作簡單——在血清存在時亦具有可靠的轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染后無需去除復合物或更換新鮮培養(yǎng)基

高性價比——經(jīng)濟的價格，同時實現(xiàn)高效的轉(zhuǎn)染效果

05/適用范圍

PolyShooter Transfection Reagent采用陽離子高分子聚合物為主要成分，適用于DNA、RNA的轉(zhuǎn)染。

06/實驗流程概要

07/實驗步驟（以24孔板為例，其他培養(yǎng)板加樣體積參考表一：轉(zhuǎn)染量度標準）

1: 準備待轉(zhuǎn)染細胞

貼壁細胞：轉(zhuǎn)染前一天，將消化后的細胞按照每孔0.3-2x105個細胞的量進行鋪板，使其在轉(zhuǎn)染時密度為50%-60%。

懸浮細胞：轉(zhuǎn)染當天，配制轉(zhuǎn)染試劑-核酸復合物之前，在24孔板中進行細胞鋪板，每500 µL生長培養(yǎng)基中加入2-5x105個細胞。

? 細胞狀態(tài)會極大影響轉(zhuǎn)染效率，待轉(zhuǎn)染細胞應(yīng)處于良好生長狀態(tài)，建議使用生長處于指數(shù)期、存活率大于90% 的細胞進行轉(zhuǎn)染。

2: 準備PolyShooter轉(zhuǎn)染試劑-核酸復合物

（1）取1 μg質(zhì)粒加入到1.5 mL離心管中，加入2.5 μL* PolyShooter 轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)?；旌?，室溫孵育3分鐘。

? * 轉(zhuǎn)染試劑使用量受細胞類型及其他實驗條件影響，通常情況下，DNA（μg）和 PolyShooter轉(zhuǎn)染試劑（μL）的用量比例為1：2.5。建議初次使用時，可在1：2-1：5的范圍內(nèi)調(diào)整以優(yōu)化轉(zhuǎn)染效果。

（2）往上述混合物中加入100 μL無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基（與培養(yǎng)體系一致，且無血清無雙抗），輕輕混勻，在室溫下靜置30分鐘，形成PolyShooter轉(zhuǎn)染試劑-核酸復合物。

? PolyShooterTM轉(zhuǎn)染試劑-核酸復合物在室溫下4個小時內(nèi)保持穩(wěn)定。

3: 細胞轉(zhuǎn)染

給細胞更換新鮮的預(yù)熱的*培養(yǎng)基500 μL/孔，將上述100 µL PolyShooter 轉(zhuǎn)染試劑-核酸復合物加入每孔細胞，輕輕搖動培養(yǎng)板混勻。

? 對于懸浮細胞系：轉(zhuǎn)染5小時后，可選擇加入PMA和/或PHA以提高CVM啟動子的活性并促進基因表達。對于Jurkat細胞，PHA和PMA的終濃度分別為1 µg/mL和50 ng/mL，可以提高CMV啟動子活性和基因表達。對于K562細胞，只加入PMA足以提高啟動子活性。

4. 分析轉(zhuǎn)染細胞

轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)24-48小時后，可根據(jù)實際情況用熒光檢測法、Western Blot、RT-PCR、ELISA、流式細胞術(shù)、報告基因等檢測轉(zhuǎn)染效果，或加入篩選藥物進行穩(wěn)定細胞株的篩選。

08/注意事項

1. 核酸質(zhì)量：想要獲得最高的轉(zhuǎn)染效率和更低的細胞毒性，應(yīng)選用高純度、無菌、無污染、無內(nèi)毒素的優(yōu)質(zhì)核酸。質(zhì)粒中的內(nèi)毒素是轉(zhuǎn)染的大敵，內(nèi)毒素會導致轉(zhuǎn)染效率顯著下降，特別是對內(nèi)毒素敏感的細胞，例如原代細胞、懸浮細胞、造血細胞等。推薦使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒進行質(zhì)粒提取，保證質(zhì)粒A260/A280比值為1.8-2.0。同時，需合理計算質(zhì)粒用量，轉(zhuǎn)染過量的質(zhì)?？赡軙е录毎拘陨踔了劳?；

2. 細胞質(zhì)量：細胞狀態(tài)會極大影響轉(zhuǎn)染效率，建議使用生長處于指數(shù)期、存活率大于90%的細胞進行轉(zhuǎn)染；

3. 細胞密度：建議細胞傳代后12-24 h內(nèi)、細胞密度為50%-60% 時進行轉(zhuǎn)染。不同的細胞轉(zhuǎn)染實驗，對細胞密度的要求不盡相同。在進行不同核酸或不同細胞系的轉(zhuǎn)染時，需要根據(jù)說明書再次優(yōu)化實驗條件。此外，在實驗過程中保證相同的接種條件，確保實驗數(shù)據(jù)的可重復性；

4. 質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑使用比例：對于大多數(shù)細胞系，轉(zhuǎn)染復合物中DNA (μg)與PolyShooter Transfection Reagent (μL) 的比例在1：2至1：5之間，推薦比例為1:2.5。想要獲得*的轉(zhuǎn)染結(jié)果，需要對這一比例進行優(yōu)化，根據(jù)所轉(zhuǎn)染細胞及質(zhì)粒選擇適合的轉(zhuǎn)染比例；

5. PolyShooter Transfection Reagent可用于有血清培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)染，并且轉(zhuǎn)染前后不需要換培養(yǎng)基。但是，制備轉(zhuǎn)染復合物時要求用無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑，因為血清會影響復合物的形成；

6. 由于一些特殊培養(yǎng)基中的某些成分可能會抑制陽離子聚合物介導的轉(zhuǎn)染，因此有必要檢測特殊培養(yǎng)基與PolyShooter Transfection Reagent的相容性；

7. 為了您的健康安全，請規(guī)范操作，穿戴實驗服與手套開展實驗；

8. 本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及治療。

09/實驗案例分析

1: 轉(zhuǎn)染前一天，將圖2所示9種狀態(tài)良好的細胞接種于24孔板，使其在轉(zhuǎn)染時密度約為50%。

2: 按照每孔計量，取1μg GFP質(zhì)粒加入到1.5 mL離心管中，加入2.5 μL PolyShooter Transfection Reagent與質(zhì)粒混合，室溫孵育3 min后，往混合物中加入100 μL無血清基礎(chǔ)DMEM培養(yǎng)基，輕輕混勻，在室溫下靜置30 min，形成PolyShooter轉(zhuǎn)染試劑-核酸復合物。

3: 給細胞更換新鮮的預(yù)熱的*培養(yǎng)基500 μL/孔，將上述100 µL PolyShooter 轉(zhuǎn)染試劑-核酸復合物加入每孔細胞，輕輕搖動培養(yǎng)板混勻。

4：轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)48小時后，用熒光顯微鏡檢測GFP綠色熒光蛋白表達情況，并拍照記錄，實驗結(jié)果如圖2所示。

圖2: 轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)48小時后，用熒光顯微鏡檢測GFP綠色熒光蛋白表達情況

10/其他相關(guān)產(chǎn)品