ViralStars LC Lentivirus Concentration Solution(5x)

CatalogNumber：LC110R

01/產(chǎn)品概述

　　基于人類免疫缺陷病毒-1（HIV-1）的慢病毒載體是一種用于基因轉(zhuǎn)移研究的載體。慢病毒載體可以將外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)目的序列的效果。在感染能力方面，慢病毒載體可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞。對(duì)于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，使用慢病毒載體能大大提高目的基因或目的shRNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率大大增加，能夠比較方便快捷地實(shí)現(xiàn)目的基因或目的shRNA的長(zhǎng)期、穩(wěn)定表達(dá)。在體外實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究中，慢病毒己經(jīng)成為表達(dá)外源基因或外源shRNA的常用載體形式之一，并且正在獲得越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。

　　LeapWal ViralStars 慢病毒濃縮試劑（5x）是針對(duì)慢病毒富集而優(yōu)化的聚合物材料，它提供了一種簡(jiǎn)單、快速、高效的慢病毒顆粒濃縮方法。只需將慢病毒上清液與慢病毒濃縮試劑按比例混合，短時(shí)間孵育，采用標(biāo)準(zhǔn)離心機(jī)進(jìn)行離心即可得到慢病毒顆粒沉淀。超濾、超速離心法等病毒濃縮法，操作時(shí)間長(zhǎng)，步驟繁瑣，且通常會(huì)有細(xì)胞碎片和血清蛋白等的污染，病毒純度低。使用本產(chǎn)品進(jìn)行病毒濃縮后，病毒滴度可提高10-100倍，病毒回收率最高可達(dá)約90%，病毒損失少，并且病毒在濃縮過(guò)程中能保持病毒生物活性。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程可在4小時(shí)內(nèi)快速完成，無(wú)需超速離心即可獲得出色的回收效率。

02/產(chǎn)品組分

03/保存條件

冰袋（wetice）運(yùn)輸。4℃保存，有效期12個(gè)月。

04/產(chǎn)品特點(diǎn)

　　簡(jiǎn)單快速——操作簡(jiǎn)單，無(wú)需超速離心，確保活性，實(shí)驗(yàn)耗時(shí)不超過(guò)4小時(shí)

　　濃縮效果優(yōu)——病毒滴度可濃縮10-100倍以上（TransductionUnits/mL）

　　回收效率高——慢病毒回收效率高達(dá)90%以上

　　應(yīng)用范圍廣——適用于所有類型的慢病毒顆粒

05/實(shí)驗(yàn)流程概要

06/實(shí)驗(yàn)步驟

　　1.將含有慢病毒顆粒的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至無(wú)菌容器中，300xg離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片。

　　?為保證病毒活性，濃縮前的病毒上清液應(yīng)盡量選擇新鮮收集的病毒原液。

　　2.使用0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾上清液至無(wú)菌容器中。

　　?如果使用濾膜過(guò)濾，推薦使用低蛋白結(jié)合力的纖維素醋酸酯或聚醚砜（PES）膜，不推薦使用硝酸纖維素膜（NC）。

　　3.向每4體積含慢病毒的上清液中加入1體積慢病毒濃縮試劑（5x），使慢病毒濃縮試劑（5x）稀釋為工作濃度（1x）。

　　4.將上述混合物于4℃搖床中慢速孵育3小時(shí)或過(guò)夜。

　　?慢病毒顆粒在4℃可穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá)4天。

　　5.將混合物4℃4000xg離心25分鐘。離心后，慢病毒顆?？赡茉谌萜鞯撞匡@示為米色或白色沉淀。

　　6.小心棄去上清液，4℃4000xg離心5分鐘，再次棄盡殘余液體，應(yīng)盡量避免吸走沉淀物，該沉淀物即為慢病毒顆粒。

　　7.用初始體積（原上清液體積）1/10-1/100預(yù)冷的慢病毒保存液重懸病毒顆粒，使用移液器小心吹打，重懸慢病毒顆粒。

　　?重懸病毒沉淀時(shí)，吹打操作要輕柔，可選擇慢病毒保存液（LS110R）、*培養(yǎng)基或FBS重懸慢病毒。

　　8.小體積分裝慢病毒，儲(chǔ)存于-80℃冰箱或液氮中，留取少量病毒測(cè)定滴度。

　　?應(yīng)盡量避免慢病毒反復(fù)凍融，否則會(huì)降低病毒滴度。

07/適用范圍

　　LeapWal ViralStars 慢病毒濃縮試劑（5x）適用于任何慢病毒顆粒的濃縮方法。

08/注意事項(xiàng)

　　1.為了您的健康安全，請(qǐng)規(guī)范操作，穿戴實(shí)驗(yàn)服與手套開展實(shí)驗(yàn)；

　　2.所有慢病毒操作均需在生物安全柜（BSL2級(jí)）中進(jìn)行；

　　3.本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于臨床診斷及治療。

09/實(shí)驗(yàn)案例分析

　　1.使用10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line（CL110001），待細(xì)胞密度為60-70%左右開始包裝慢病毒；

　　2.使用ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit（LP110-10）進(jìn)行慢病毒包裝（陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒含GFP綠色熒光蛋白基因），具體包裝步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行；

　　3.準(zhǔn)備目的細(xì)胞：將需感染的目的細(xì)胞293T以(1-3)x10^4的密度接種于96孔板內(nèi)，次日即可進(jìn)行慢病毒感染；

　　4.待病毒包裝48h后，收集慢病毒上清液約9mL，300xg離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片，使用0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾上清液至無(wú)菌容器中。

　　5.取1mL病毒上清液作為濃縮前對(duì)照1*，剩余8mL病毒上清液中加入2mL本產(chǎn)品進(jìn)行慢病毒濃縮，具體慢病毒濃縮步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行，保留1mL濃縮后應(yīng)棄去的上清液作為對(duì)照2#，使用800μL *培養(yǎng)基輕輕重懸慢病毒顆粒，即可得到濃縮10倍的慢病毒；

　　6.慢病毒感染目的細(xì)胞：將96孔板細(xì)胞棄去上清，每孔加入新鮮培養(yǎng)基100μL，Polybrene（LE110-01）0.2μL，濃縮后慢病毒100μL或?qū)φ?*（濃縮前慢病毒原液）100μL或?qū)φ?#（濃縮后應(yīng)棄去的慢病毒上清液）100μL；

　　7.繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48h后，使用熒光顯微鏡觀察綠色熒光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2: 慢病毒感染目的細(xì)胞293T觀察GFP表達(dá)情況。（左）濃縮10x慢病毒，（中）對(duì)照1*（濃縮前慢病毒原液），（右）對(duì)照2#（濃縮后應(yīng)棄去的慢病毒上清液）。

10/其他相關(guān)產(chǎn)品